Referat Metode Biochimice Utilizate In Aprecierea Efectului Poluantilor Din Mediu Asupra Organismului

Mai jos puteti citi fragmente din Referat Metode Biochimice Utilizate In Aprecierea Efectului Poluantilor Din Mediu Asupra Organismului si de asemenea puteti face Download Referat Metode biochimice utilizate in aprecierea efectului poluantilor din mediu asupra organismului

Citeste fragmente din Referat Metode Biochimice Utilizate In Aprecierea Efectului Poluantilor Din Mediu Asupra Organismului

Metode biochimice utilizate in aprecierea efectului poluantilor din mediu asupra organismului Determinarea sulfiţilor din sânge Generalităţi: prezenţa sulfiţilor în sânge a fost considerată ca indicator de expunere la bioxidul de sulf. Incostanta cu care au fost puşi în evidenţă, semnificaţia acestui indicator bichimic la expunerile la concentraţii ridicate. Principiul metodei: bioxidul de sulf din sânge formează cu reactivul fuxin formolic un complex colorat a cărui intensitate este proporţională cu concentraţia. Reactivi: -formaldehidă, soluţie 40%; -pararozanilină 3% în soluţie alcoolică; -reactiv fuxin-formolic; -hidroxid de potasiu, soluţie alcoolică 1%; -soluţie saturată de clorură mercurică(HgCl2); -soluţie etalon stoc pentru bioxid de sulf; -soluţie etalon de lucru. Recoltarea probelor de sânge: sângele care se recoltează din deget e un anticoagulant. Mod de lucru: într-o eprubetă de centrifugă se introduc 0,5 ml soluţie alcoolică de KOH 1%, 2,2 ml apă bidistilată şi 0,2 ml sânge. Eprubeta se agită timp de 2-3 minute apoi se adaugă 1 ml soluţie saturată de clorură mercurică, agitând din nou. Se centrifughează la 4000 turaţii, timp de 5 minute şi apoi se iau cu atenţie din supernatant 2 ml şi se introduc într-o eprubeta peste care se adauga 4 ml reactiv foxin-formolic. Dupa 5’ se citeşte extincţia la spectrofotometru la lungimea de undă de 570 nm în cuva de 1 cm. Valoarea extincţiei se raportează la curba de etalonare care se întocmeşte după schema de mai jos: Concentraţia SO2/proba µg 0 1 3 5 7 9 10 Soluţia etalon de lucru ml 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0 Apă bidistilată ml 1,5 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,5 Soluţia de clorură mercurică ml Câte 0,5 ml Reactiv fuxin-formolic Ml Câte 4 ml După fiecare adăugare de reactiv se agită eprubetele. Se lasă apoi 5’ în repaus şi se citeşte extincţia în aceleaşi condiţii ca şi proba. Se trasează curba de etalonare. Calcul: mg SO2% =c/v ·10 C =concentraţia înµg SO2 din proba de sânge; V =cantitatea de sânge luată în lucru, în ml. Determinarea fluorului din urină Generalităţ: calea principală de eliminare a fluorului din organism este cea renală. La o ingestie normală de fluor, concentraţia fluorului urinar este proporţională cu ingestia. Dacă organismul este expus la concetraţie crescută de fluor, nivelul fluorului din urină creşte, dar fără a se menţine proporţionalitatea cu gradul de expunere. Principiul metodei: fluorul este separat din urină prin microdifuzie sub forma de HF, care este prins pe o peliculă de hidroxid de sodiu ca fluorura de sodiu. Dozarea se face colormetric, prin decolorarea lacului SPANDS- azotat de thoriu, proporţional cu concentraţia fluorului. Reactivi şi material necesar: -hidroxid de sodiu: soluţie alcoolică 0,05 N; -acid percloric 70%; -azotat de thoriu 0,004M; -soluţie etalon stoc pentru fluor; -SPANDS, 0,004 M; -soluţie etalon stoc entru fluor; -soluţia etalon de lucru; -sulfat de argint, pulbere; -acid clorhidric 0,05; -2,5 ml soluţie de azotat de thoriu 0,004 M; -5,0 ml soluţie SPANDS 0,004 M; -0,04 soluţie de HCl 0,05 N; -apă bidistilată; -cutii din polistiren folosite la ambalajul medicamentelor (faringosept sau B complex); -capace din plastic cu care se astupă flacoanele de vitamina C. Recoltarea se face din urina din 24 de ore, într-un recipient de polistiren. Mod de lucru: 2 ml urină se introduc într-un capacel de plastic care se amplasează în capacul unei cutii de polistiren. În corpul aceleiaşi cutii se introduce 1 ml soluţie alcoolică de hidroxid de sodiu şi se lasă la etuvă la 60˚C pentru evaporarea alcoolului şi formarea peliculei de hidroxid de sodiu. În căpăcelul cu urină se introduc 0,1g sulfat de argint şi 2 mg acid percloric, se închide imediat cutia şi se lipeste o fâşie de leucoplast în jurul cutiei pentru a evita pierderile de fluor. Paralel cu proba, în condiţiile identice se procedează pentru proba martor (apa bidistilată) şi 5 etaloane care conţin cantităţi succesive de fluor (1; 3; 5; 7; 10 µg F) introducându-se în fiecare căpăcel câte 0,1; 0,3; 0,7; şi 1,0 ml soluţie etalon de lucru de fluorură de sodiu. Se completeaza apoi volumul cu apă bidistilată până la 2 ml. În continuare se procedează ca şi pentru proba de urină. Cutiile bine închise se introduc în etuvă la 58˚-60˚C, timp de 20 ore pentru realizarea difuziei. Se scot cutiile de la etuvă şi în corpul cutiei unde s-a realizat pelicula de hiroxid şi fixarea fluorului se introduc 2 ml apă bidistilată, 4 ml acid clorhidric 0,05 N şi 4 ml lac SPANDS-azotat de thoriu.După 10’ se citeşte extincţia de la spectrofotometru la lungimea de undă de 580 nm în cuva de 1 cm. Cu valorile extincţiilor obţinute pentru proba martor şi etaloane se trasează o curbă. Calcul: mg F/dm3 = c/v C =concentraţia în µg fluor din proba de urină luată în lucru; V =cantitatea de urină luată în lucru, în ml; Obs.: concentraţia fluorului în urină la o expunere normală de fluor este între 0,5-1,5 mg/dm3. Determinarea mercurului din urină Generalităţi: creşterea concentraţiei mercurului în urină poate indica depozitarea de mercur sau intoxicaţie cu acest metal. Totuşi rezultatele sunt neconstatate, după pătrunderea în organism mercurul dispărând repede din sânge în urină. Mai constant şi cu valoare mai ridicată pentru diagnosticul de expunere este determinarea Hg în păr şi unghii. Principiul metodei: mercurul formează cu difeniltiocarbazona un complex colorat la pH =1,5-2,0. Reactivi: -E.D.T.A-Na2, soluţie 0,1 N; -acid sulfuric conconentrat d= 1,84; -acid sulfuric diluat; -permanganat de potasiu, soluţie saturată; -galben de metanil, soluţie 0,1%; -roşu de fenol, soluţie 0,1%; -ditizonă, soluţie stoc 0,1% în cloroform; -ditizonă soluţie de lucru; -soluţie de hidroxilamină 10%; -soluţia e spălare; -toluen pur; -soluţia etalon stoc pentru mercur; -amoniac concentrat. Recoltarea probelor: urina se recoltează din prima emisiune de dimineaţă sau urina colectată în 24 ore (vasele în care se face recoltarea trebuie bine clătite) cu soluţie de acid azotic (1:25) şi apoi cu apa bidistilată. Mod de lucru: într-o capsulă de porţelan se introduc 50 ml urină, 5 ml H2SO4 concentrat (d =1,840) şi 15 ml soluţie saturată de permanganat de potasiu. Se încălzeşte moderat pe baia de nisip fără a ajunge la fierbere, acoperind vasul cu o sticlă de ceas, până ce lichidul supernatant devine limpede şi incolor prezentând pe fundul vasului un precipitat brun. Dacă precipitatul lipseşte înseamnă că trebuie să se mai adauge soluţie de permanganat de potasiu şi se continuă încălzirea până ce lichidul supernatant se decolorează complet. După răcire excesul de permanganat se îndepărtează cu hidroxilamina adăugând picătură cu picătură până la disparţia precipitatului brun şi apoi un exces de 5 ml hidroxilamină. Se trece proba cantitativ într-o pâlnie de separare, se ajustează pH-ul la 1,2-2,0 aşa cum s-a arătat la determinare mercurului din aer şi se procedează în continuare la fel ca şi la aer. Calcul: µg mercur/dm3 urină = C x 20 C = concentraţia în µg mercur din proba de urină luată în lucru µg mercur/urina din 24 ore = C x 20 x V24. V24 = cantitatea de urină colectată în 24 ore, în litri. Obs.: valoarea normală a mercurului în urină este de 30 µg/urina din 24 ore. Determinarea mercurului din păr Principiul metodei: ionii de mercur în mediul acid formează cu difenilcarbazona un complex colorat în portocaliu, ditizonatul de mercur, care se extrage cu toluen şi se poate colorimetra. Reactivi şi material necesar: -acid azotic d= 1.41 şi soluţii apoase de 2% şi 10% în volume; -acid sulfuric d= 1,84 şi soluţie apoasă de 50% în volume; -hidroxid de amoniu soluţie 25%; -parmangant de potasiu soluţie saturată; -clorură stanoasă10% în HCl concentrat; -galben de metalin soluţie apoasă 0,1%; -roşu de fenol 0,1; -ditizonă soluţie stoc 0,1% şi 0,5%; -ditizonă, soluţia de lucru; -clorhidrat cu hidroxilamină, soluţie 10%; -E.D.T.A.- sarea de sodiu; -clorură stanoasă soluţie 10%; -soluţia de spălare; -soluţie etalon stoc; -apă bidistilată în prezent permanganatului de potasiu şi hidroxidului de sodiu. Mod de lucru : în balonul cu fundul rotund de la aparatul de distilat mercur se introduc 2 g păr, câţiva ml de apă bidistilată, 10 ml acid azotic, 10 ml apă oxigenată şi 2 ml clorură stanoasă 10% în acid clorhidric. Se fixează balonul la parat şi se da drumul la foc foarte încet. Se distilează aproximativ 1/2 oră şi se continuă determinarea la fel ca la determinarea mercurului din apă. Determinarea plumbului în sânge Generalităţi: plumbul se găseşte în sânge atât sub forma anorganică cât şi legat de unele substanţe organice. Cea mai mare parte a plumbului din sânge, se găseşte în eritrocite. Concentraţia plumbului în sânge ne dă indicaţii cu privire la indigestia şi eliminarea lui în organism, mai precis la cantitatea de plumb pe care organismul o fixează. Principiul metodei: plumbul are proprietatea de a reacţiona cu difenilcarbazona, în mediul alcalin cu care formează un complex colorat în roşu, ditizonatul de plumb, colorimetrabil. Reactivi: -acid azotic (d= 1,40); -acid azotic 1% şi 0,05% în clorofrom; -cloroform; -ditizonă 0,01% şi 0,05% în cloroform; -soluţia tampon de citrat; -soluţia de spălare; -soluţia etalon stoc pentru plumb; -soluţia etalon de lucru; -acid tricloracetic 10% şi 5%; -acid percloric 70%. Recoltarea: sângele se recoltează prin puncţie venoasă cu un ac sterilizat prin fierbere în apă distilată, pe fluorura de sodiu (0,1) ca anticoagulant. Modul de lucru: 10 ml de sânge bine omogenizat se introduc într-o eprubeta de centrifugă de 50 ml în care se află 10 ml apă bidistilată. Se amestecă bine cu o baghetă de sticlă pentru a se realiza hemoliza şi apoi se adaugă 10 ml acid tricloracetic 10%, picătură cu picătură sub agitare continuă. Se lasă apoi o oră în repaus şi se centrifughează la 3000 turaţii, timp de 5’. Supernatantul se trece într-o capsula de porţelan. În eprubeta de centrifugă se mai adaugă 10 ml acid tricloraceti. Se adaugă 5 ml acid azotic 5% şi se amestecă bine centrifugâdu-se din nou. Supernatantul se separă în aceeaşi capsulă. Peste fracţiunile extrase în tricloracetic se adaugă 5 ml acid azotic concentrat (d = 1,42) şi se încălzeşte pe baia de nisip până rămân aproximativ 5 ml lichid. După ce s-a răcit se adaugă 0,5 ml până la uscare. Dacă reziduul nu este alb se mai adaugă 1 ml acid azotic şi 2-3 picături de acid percloric şi se evaporă din nou la sec. Se repetă operaţia până ce reziduul este perfect alb. Se adaugă apoi 2 ml apă bidistilată şi se evaporă iarăşi până la sec. Peste reziduul uscat se adaugă 10 ml acid azotic (1 :25) şi apoi conţinutul se trece cantitativ într-o pâlnie de separare cu porţiuni mici de apă bidistilată (să nu depaşească volumul final 40 ml). Se adaugă 15 ml soluţie tampon şi dacă proba se tulbură se mai adaugă soluţie tampon până la limpezirea completă. Paralel se face o probă martor folosind 15 ml acid tricloracetic care se tratează la fel ca şi proba. În continuare se procedează la fel pentru determinarea plumbului în apă şi aer. Calcul : µg Pb/100 ml sânge = C x 10 C = concentraţia în µg Pb din proba de sânge luată în lucru; Obs.: valoarea normală a plumbemiei este de 30 µg/100 ml sânge. Determinarea plumbului în urină Generalităţi: plumbul în urină se găseşte sub formă de combinaţii organice şi anorganice. Concentraţia plumbului din urină ne poate da unele indicaţii cu privire la impregnarea organismului cu plumb. Principiul metodei: plumbul are proprietatea de a reacţiona cu ditizona, în mediu alcalin cu care formează un complex colorat în roşu, ditizonatul de plumb, colorimetrabil. Reactivi: -acid azotic (d= 1,40) ; -acid azotic 1% şi 0,05%; -cloroform; -ditizonă 0,01% şi 0,05%; -soluţia tampon de citrat ; -soluţia de spălare; -soluţia etalon stoc; -soluţia etalon de lucru; -permanganat de potasiu, soluţie saturată; -soluţie de hidroxilamină 10%. Recoltarea: urina se recoltează în vase bine spălate cu detergent şi clătite cu o soluţie de acid azotic 1:10 şi cu apă bidisitlată. Recoltarea urinei se face din prima emisiune de dimineaţă sau din urina colectată în 24 de ore. Mod de lucru: într-o capsulă de porţelan se introduc 25 ml urină şi se adaugă 2,5 ml acid azotic (d = 1,42) şi 8,5 ml soluţie saturată de parmanganat de potasiu. Se încălzeşte pe baia de nisip, moderat, până ce lichidul supernatant devine limpede şi incolor. Pe fundul vasului trebuie să persiste un rest de precipitat brun. În caz contrar se mai adaugă câţiva ml de permanganat continuâdu-se încălzirea. După răcirea parţială a soluţiei, se tratează excesul de permanganat cu hidroxilamină, adăugându-se picătură cu picătură până la dispariţia completă a precipitatului brun şi apoi un exces de 2 ml. Paralel cu proba de urina se face un martor cu apă bidistilată şi care se lucrează în aceleaşi condiţii ca şi proba. Se trece continutul din capsulă cantitativ într-o pâlnie de separare cu porţiuni mici de apă bidistilată să nu depăşească 40 ml. Se adaugă 15 ml soluţie tampon până la limpezirea completă. Calcul: µg Pb/dm3 urina= c/v ·V24 C= concentraţia în µg Pb din proba de urină luată în lucru V= cantitatea de urină luată în lucru, în ml V24= cantitatea totală de urina eliminată în 24 de ore în ml Obs.: Valoarea normală a plumbului în urină este de 50 µg/urina/24 ore. Determinarea enzimei ∆ amino-levulinic Dehidraza (ALA-dehidraza) Generalităţi: enzima ALA-dehidraza intervine în biosinteza hemului la etapa de cuplare a celor două molecule de acid molecule de acid ∆ amino-levulinic pentru a forma porfobilinogenul, precursorul nucleului porfirinic. Activitatea acestei enzime este inhibată în cazul expunerii organismului la plumb. Principiul metodei: activitatea ALA-dehidrazei se determină prin dozarea colormetrică a porfobilinogenului din sânge înainte şi după incubarea sângelui total cu acid ∆ amino-levulinic ca substrat. Reactivi: -acid ∆ amino-levulinic 0,01 M; -reactiv; -deproteinizant: acid tricloracetic 10%; Recoltarea probelor: sângele se recoltează prin puncţie venoasă pe heparină. Mod de lucru: în 2 eprubete de centrifugă care se notează cu P şi M se introduc în fiecare câte 0,2 ml sânge heparinizat şi 1,3 ml apă bidistilată, se amestecă uşor şi apoi se introduc într-o baie termostat la 37˚C timp de 10’ pentru realizarea hemolizei. În eprubeta P se introduce 1 ml acid ∆ amino-levulinic (substrat) iar în eprubeta M 1 ml acid tricloracetic, se agită şi apoi 1 ml acid ∆ amino-levulinic. Ambele eprubete se ţin la incubat timp de 60’ la 37˚C. După incubare se adaugă şi în eprubeta P 1 ml acid tricloracetic. Se centrifughează ambele eprubete la 3000 rotaţii timp de 10’. Se ia din supernatant câte 1 ml şi se introduce în alte 2 eprubete peste care se adaugă 1 ml reactiv Ehrlich. Calcul: unităţi ALA-dehidraza/ml eritrocite = 12,5 x E60 – E0/ % hematocrit x1000 E60= valoarea extincţiei probei din eprubeta P. E0= valoarea extincţiei din eprubeta M. Obs.: se consideră ca valori normale pentru activitatea ALA-dehidrazei 25 unităţi/l de eritrocite. Determinarea hematocritului (volumul eritrocitelor) Principiul metodei: sângele se centrifughează şi se separă eritrocitele de plasmă iar prin evaluarea raportului cantitativ între ele se obţine volumul eritrocitelor. Reactivi şi material necesar: -centrifuga; -anticoagulant-heparina; -material pentru recoltarea sângelui prin puncţia venoasă; -hematocrit. Recoltarea probei de sânge: sângele se recoltează prin puncţie venoasă heparina (o picătură de heparină este suficientă pentru 5 ml sânge). Mod de lucru: sângele se introduce în hematocrit şi se centrifughează la 4000 rotatii timp de 20’. După centrifugare se măsoară înălţimea „h” a coloanei de eritrocite şi înălţimea „H” a coloanei totale de sânge. Dacă tubul este gradat în mm se face citirea direct, dacă nu este gradat, înălţimea se măsoară cu ajutorul unei rigle. Calcul: hematocrit% =100 x h/H. h= înălţimea coloanei de eritrocite, în mm; H= înălţimea coloanei totale de sânge, în mm; Obs.: valori normale ale hematocritului: bărbaţi 44,9%; femei 40,7%. Determinarea acidului ∆ amino-levulinic în urină Generalităţi: ca şi coproporfirinele, concentraţia acidului delta-amino-levulinic creşte în urină în expunerea organismului la concentraţii crescute de plumb în urma perturbării biosintezei hemului produsă de prezenţa plumbului. Principiul metodei: acidul ∆ amino-levulinic se separă din urină prin reţinerea lui pe o coloană cu răşini schimbătoare de ioni, cationică şi determinarea colorimetrică cu reacticul Ehrlich. Reactivi şi material necesar: -hidroxid de sodiu 1 N; -acid clorhidric 1 N şi 2 N; -tampon acetat, pH = 4,6; -acetat de sodiu 2 M; -acid acetic glacial; -acid acetic soluţie 1 M şi 0,2 M; -acetilacetonă; -acid percloric 70%; -răşină cationică DOWEX 50 - x 8, granulaţie 200-400 mesh forma H+; -răşină anionică (pentru îndepărtarea porfobilinogenului) răşină DOWEX 2- x8 sau DOWEX 1- x8 cu granulaţia de 200-400 mesh sub formă de acetat; -reactiv Erlich. Recoltarea probelor: urina se recoltează din prima emisiune de dimineaţă sau din urina colectată în 24 ore şi se lucrează cât se poate de repede. Mod de lucru: cele 3 coloane se aşează una deasupra celeilalte având grijă ca deasupra să fie coloana anionică. Se introduc în coloane 8 ml apă bidistilată şi se aşteaptă să treacă complet prin cele două coloane [în coloana anionică s-a reţinut porfobilinogenul iar în cea cationică acidul ∆ amino-levulinic (ALA)]. În coloana cationică se introduc 7 ml acetat de sodiu 1 M care este prins într-o eprubetă gradată de 10 ml. Se completează volumul la 10 ml cu soluţie tampon de acetat şi se adaugă apoi 0,2 ml acetilacetonă, se agită bine eprubeta se adaugă 2 ml reactiv Ehrlich şi se amestecă bine. Se lasă în repaus 15’ apoi se citeşte extincţia la spectrofotometru la lungimea de undă de 553 nm în cuva de 1 cm. Citirile se fac faţă de un martor preparat din 2 ml apă bidistilată şi 2 ml reactiv Ehrlich. Calcul: mg ALA/dm3 urina =E553 x 47,6. Valoarea normală a acidului ∆ amino-levulinic în urină este de 5,2 mg/urina din 24 ore. Determinare porfirinelor urinare Generalităţi: perturbarea biosintezei hemului este unul din efectele toxicităţii plumbului evidenţiată prin creşterea excreţiei urinare de coproporfirine şi acid ∆ amino-levulinic. Principiul metodei: porfirinele urinare sunt extrase şi aduse în soluţie cu acid clorhidric apoi se măsoară extincţia la lungimea de undă maximă a bandei de absorbţie caracteristică porfirinelor. Concentraţia porfirinelor se calculează pe faza coeficientului de extincţie molar. Reactivi: -acid acetic glacial; -eter etilic; -acetat de etil; -acid clorhidric soluţie 0,1 N şi 0,5 N; -soluţie de iod 0,1 N; -tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1 N. - Œ Ž ¤ ¦ Ì Î H J € ‚ ˜ š   ® ° Ä Æ Ú Ü î ð ô ö ú ü 8 L ¤ ü þ h h h h h h ? ferită de lumină, sau urina colectat în 24 ore în care se adaugă 2 ml toluen pentru conservare. Mod de lucru: într-o pâlnie de separare se introduc 5 ml urină şi 1 ml acid acetic. Dacă proba de urina este proaspătă, se oxidează prin adăugarea a 5 picături de soluţie de iod iar excesul se îndepărtează prin adăugarea a 5 picături de tiosulfat. Probele colectate în 24 ore nu se mai oxidează. Se adaugă 30 ml eter etilic şi se agită bine proba timp de 3’. Se separă stratul de urină în altă pâlnie. În prima pâlnie se adaugă de 2 ori câte 5 ml de apă bidistilată şi stratul apos se separă tot în cea de-a doua pâlnie. Peste stratul eteric (pâlnia 1) se adaugă porţiuni succesive de câte 1 ml de HCl 0,1 N agitând de fiecare dată pâlnia câte 1’ iar extracţiile acide sunt unite într-o eprubetă gradată de 10 ml. Sunt suficiente 4 extracţii cu acid şi se completează volumul până la 5 ml cu acid. Dacă concentraţia porfirinelor este prea mare, culoarea extrasului are o nuanţă roz. Se continuă extracţia cu acid până ce ultima fracţiune extrasă nu mai prezintă fluorescenţă roşie la lumina ultravioletă şi în acest caz volumul final se completează până la 10 ml cu acid. În extrasul acid sunt conţinute coproporfirinele. În pâlnia a doua în care se află urina şi apa de spălare se adaugă 30 ml acetat de etil şi se agită pâlnia 3’. Se îndepărtează faza apoasă iar stratul de acetat de etil se spală de 3 ori cu câte 5 ml apă bidistilată. Fracţiunile apoase se elimină. Peste acetatul de etil se introduc porţiuni de câte 1 ml HCl, 0,5 N şi în stratul acid sunt extrase uroporfirinele. Fracţiunile acide sunt unite într-o eprubetă gradată de 10 ml şi se completează volumul până la 5 ml acid clorhidric 0,5. Extincţia extraselor acide se măsoară la spectofotometru la mai multe lungimi de undă şi anume: 380 nm, 401 nm, 405 nm. Calcul: µg coproporfină/dm3 urina =[2Emax –(E380+E430)]V/V1·817. Emax= valoarea exticţiei la 401 nm; E380= valoarea exticţiei la 380 nm pentru interferenţe; E430= valoarea exticţiei la 430 nm pentru interferenţe; V= cantitatea finală a extraselor acide (în ml); V1= cantitatea de urină luată în lucru, în ml; µg uroporfirine/dm3 urina=[2Emax –(E380+E430)]V/V1·831. Emax= valoarea extincţiei la 405 nm. Obs.: -pentru exprimarea rezultatelor la urina din 24 ore concentraţia aflată la litru se raportează la volumul de urină din 24 ore. -pentru obţinerea extincţiei maxime se fac citiri în zona între 396-410 nm, din 2 în 2 nm; -valorile normale ale coproporfirinelor urinare sunt de 120 µg/urina din 24 ore; -valorile normale de uroporfirine urinare sunt de 20 µg/urina din 24 ore. Determinarea carboxihemoglobinei Generalităţi: oxigenul şi oxidul de carbon concurează pentru aceeaşi parte a hemoglobinei, dar afinitatea pentru oxidul de carbon a hemoglobinei este de 210 ori mai mare decât pentru oxigen. De aceea într-o atmosferă poluată cu oxid de carbon, oxigenarea ţesuturilor este deficitară din cauza creşterii procentului de carboxihemoglobină. Dacă nivelul carboxihemoglobinei este sub 10% din hemoglobina totală, presiunea parţială a oxigenului arterial este normală, totuşi la concentraţia de 4-10% s-au semnalat modificări fiziologice. Când carboxihemoglobina reprezintă 66% din hemoglobina totală, survine moartea. Principiul metodei: oxidul de carbon eliberat din caroxihemoglobină reduce soluţia de clorură paladoasă proporţional cu concentraţia oxidului de carbon. Excesul de clorură paladoasă se determină colorimetric cu iodura de potasiu: PdCl2 + CO + H2O →Pd + CO2 + 2HCl PdCl2 + 4IK→[PdI4]K2 + 2KCL Reactivi şi material necesar: -clorură paladoasă; -hemolizant de fericianură; -iodură de potasiu, soluţie 20%; -celula de microdifuzie; –celula se închide ermetic cu un dop rodat. Recoltarea probelor: sângele se recoltează prin puncţie venoasă într-un tub mic în care s-a introdus în prealabil cca. 10 mg oxalat de sodiu şi o bilă de sticlă, umplându-se complet. Se astupă cu un dop de cauciuc fără a lăsa bule de aer în interior şi se omogenizează prin răsturnare de 10-15 ori. În felul acesta proba se poate păstra 24 ore la rece. Mod de lucru: exact 1 ml din clorura paladoasă se introduce în compartimentul central al celulei iar în cel periferic se introduc 5 ml hemolizant de fericianură. Se măsoară exact 1 ml sânge şi se introduce în compartimentul periferic apoi se închide imediat celula. Se amestecă lichidele din compartimentul periferic prin rotire cu multă atenţie. Se lasă celula la temperatura camerei şi la întuneric până a doua zi (minimum 6 ore). Se pipetează cu grijă, lichidul din compartimentul central într-un balon cotat de 50 ml, filtrându-l. Se spală apoi cu porţiuni mici de apă bidistilată până ne-am asigurat că am trecut tot conţinutul. Se adaugă apoi în balon 10 ml de IK 20% şi se completează la semn cu apă bidistilată. Paralel cu proba se face un martor în care se pun numai reactivii fără sânge. Se măsoară extincţia probei şi a martorului la spectofotometru, la lungimea de undă de 50 nm în cuva de 1 cm. Calcul: mg PdCl2 redusă= Es – Ep/Es. Es= valoarea extincţiei martorului; Ep= valoarea extincţiei excesului de clorură paladoasă rămasă în probă; g COHb % din Hb totală = g COHb/100 ml sânge/ g Hb totală/100 ml sânge x 100. Obs.: valoarea normală a COHb este de 1,5% din Hb totală pentru nefumători şi de 10% din Hb totală pentru fumători. Determinarea oxidului de carbon din aerul expirat Principiul metodei: aerul expirat se trece printr-un tub Dräger care are o umplutură de I2O5. Oxidul de carbon reduce pentoxidul de iod la iod elementar care colorează în brun suportul alb. Material necesar: -o pungă de PVC prevăzută cu un tub de cauciuc la care este ataşată o clema şi se termină cu un tub de sticlă; -aparatul Dräger; -tub Dräger pentru oxid de carbon. Recoltarea probelor: subiectul este scos din atmosfera poluată cu oxid de carbon şi este pus sa facă 2-3 inspiraţii şi expiraţii. Inspiră apoi profund, se menţine în apnee 20’’ după care suflă forţat aerul într-o punga de PVC care se astupa bine şi se transportă în laborator. Se ataşează la punga de PVC, pompa Dräger la care aste fixat un tub Dräger pentru a determina oxidul de carbon. Se aspiră aerul din pungă cu ajutorul pompei până când stratul alb din tubul Dräger începe să se îmbruneze, oprind pomparea când îmbrunarea stratului a ajuns la o diviziune exactă. Se ţine cont de numărul de pompări care s-au efectuat. Se citesc diviziunile de pe tub până unde s-a îmbrunat suportul şi se calculează oxidul de carbon după indicaţiile date în prospectul aparatului. Cunoscând cantitatea de oxid de carbon din aerul expirat în ppm, se poate determina carboxihemoglobina, procentual din hemoglobina totală după formula: COHb% din Hb totala= ppm CO/ 5 Determinarea hemoglobinei totale Principiul metodei: hemoglobina este oxidată de fericianură la methemoglobina care cu cianura de potasiu trece în cianmethemoglobina şi este derivatul cel mai stabil al hemoglobinei al cărei coeficient molar de extincţie este stabilit. Reactivi: soluţia Drabkin: 0,14 g fosfat monopotasic, 0,05 g cianură de potasiu, 0,2 g fericianură de potasiu K3 [Fe (CN)6] se dizolvă în câţiva ml apă bidistilată. Se filtrează printr-o hârtie de filtru cantitativă, se adaugă în filtrat 0,5 g saponină, se agită şi se păstrează la rece şi în sticlă brună. Recoltarea sângelui: sângele se recoltează prin puncţie venoasă sau din capilare pe un anticoagulant. Modul de lucru: într-o eprubetă se introduc 5 ml reactivi Drabkin şi 0,02 ml sânge bine omogenizat şi măsurat cu micropipeta care se descarcă introducând pipeta în lichid fără a barbota. Se mai spală de 2-3 ori pipeta cu reactiv fără a produce barbotare. Se omogenizează proba prin scuturare şi după 10’ se măsoară extincţia la spectrofotometru la lungimea de undă de 542 nm faţă de reactivul Drabkin ca martor, în cuva de 1 cm. Calcul: g Hb totală/ 100 ml sânge= E542 x 36,8 Obs.: coeficientul molar de extincţie se poate determina dacă avem soluţii de hemoglobină standardizată dupa formulă: K= conc. Standard a Hb/ extincţie. -concentraţia standard a Hb este înscrisă pe fiolă. În lipsa standardului de Hb se foloseşte coeficientul molar de extincţie 36,8; -valori normale pentru Hb sunt: la bărbaţi – 14–16,5/ 100 ml sânge; la femei – 13-/100 ml sânge. Determinarea methemoglobinei Generalităţi: nitraţii şi nitriţii din mediu în concentraţie crescută pot da methemoglobinemii la copii până la vârsta de 1 an hrăniţi artificial. Implicaţii în oxidarea fierului din hemoglobină pentru formarea methemoglobinei sunt nitriţii. În apă însă nitriţii se găsesc în concentraţie mică din cauza labilităţii lor care în prezenta oxigenului trec uşor în nitraţi iar absenţa acestuia face ca ei să se reducă la amoniac. Nitraţii în apă pot atinge concentraţii crescute şi foarte crescute iar la nivelul tubului digestiv al copiilor mici au posibilitatea să se reducă la nitriţi, datorită florei reducătoare abundente ce există la acest nivel. Alte cauze care determină susceptibilitatea copiilor la methemoglobinemii sunt: labilitatea hemoglobinei de a trece mai uşor în methemoglobină, volum mic de sânge, echipamentul enzimatic oxido-reducător, de la nivelul eritrocitelor slab dezvoltat, concentrarea nitraţilor din apă prin procesul fierberii şi prezenţa de lapte praf a unei cantităţi crescute de flora reducătoare. Principiul metodei: methemoglobina se transformă în cianmethemoglobină care e mai stabilă şi are un coeficient molar de extincţie bine stabilit la lungimea de undă de 630 nm. Prin diferenţa dintre valoarea extincţiei înainte şi după adăugarea cianurii se obţine cantitatea de methemoglobină. Reactivi: -soluţii tampon de fosfaţi cu pH=6,6; -soluţia de cianură de sodiu sau potasiu neutralizată; -acid acetic 12%; -fericianură de potasiu 20%; -soluţie de amoniac 25%; -oxalat de sodiu, cristale; -saponină, substanţă. Mod de lucru: sângele se recoltează din deget într-un tub mic de sticlă pe oxalat de sodiu. Într-o eprubetă se introduc 10 ml soluţie tampon şi se adaugă 0,1 ml sânge descărcându-se bine pipeta prin refulare de 2-3 ori în soluţia tampon. Se amestecă bine conţinutul eprubetei apoi se adaugă aproximativ 0,1 g saponină şi se agită eprubeta timp de 5’ pentru realizarea hemolizei. Se citeşte extincţia la spectrofotometru, la lungimea de undă de 630 nm în cuva de 1 cm drum optic. După citirea extincţiei se adaugă direct în cuvă o picătură de cianură neutralizată, se amestecă bine cu o baghetă de sticlă şi dupa 2’ se citeşte din nou extincţia la aceeaşi lungime de undă. Calcul: (A-B) · 65= g% methemoglobină A= valoarea extincţiei înainte de adăugarea cianurii; B= valoarea extincţiei după adăugarea cianurii; 65= coeficient extracţie molar. Determinarea colinesterazei din sânge Generalităţi: activitatea colinesterazei din sânge este sensibil influenţată de unele substanţe toxice cum ar fi pesticidele organofosforice. Este indicat să se determine aceeaşi probă de sânge atât activitatea colinesterazei din eritrocitate cât şi cea din plasmă. Principiul metodei: prin măsurarea aceticolinei hidrolizată după incubare cu sânge total se poate aprecia activitatea colinesterazei. Acetilcolina rămasă după incubare se determină colorimetric prin reacţia cu hidroxilamina cu care formează acetilhidroxilamina care cu clorura ferică dă un complex roşu, foarte stabil. Pentru a diferenţia activitatea celor două colinesteraze se foloseşte un inhibitor specific pentru pseudocolinesterază, numit diparcol. Reactivi: -tampon barburic pH = 7,4; -clorhidrat de dietilamino-etil-fenotiazină; -acid tricloracetic 10%; -soluţia stoc de clorură de acetilonă; -soluţia de lucru de acetilcolină; -NaOH soluţie 3,5 N; -HCl soluţie 4 N; -hidroxilamină hidroclorică; -soluţie alcalină de hidroxilamină; -clorură ferică. Recoltarea probei de sânge: sângele se recoltează pe heparină sau pe alt anticoagulant. Mod de lucru: se măsoară 0,2 ml sânge şi se diluează cu 1,8 ml apă bidistilată, realizându-se o diluţie de 1/10, se agită bine pentru a se face hemoliza. Se citesc extincţiile la spectrofotomentru la lungimea de undă de 520 nnm în cuva de 1 cm faţă de martorul de reactivi. Calcul: activitatea colinesterazei se exprimă în µg acetilonă hidrolizată într-o oră la 38˚C de 1 ml sânge total. Colinesteraza totală= E-E1/ E· 100. Colinesteraza globulară =E-E2/E · 100. Colinesteraza plasmatică: colinesteraza totală – colinesteraza globulară. E= valoara extincţiei etalonului E. E1= valoarea extincţiei colinesterazei totale. E2= valoarea extincţiei colinesterazei globulare. Obs.: valori normale: -colinesteraza globulară= 34,5; -colinesteraza plasmatică= 16,8. Raportul colinesteraza globulară/ colinesteraza plasmatică = 0,66. Colinesteraza globulară se poate raporta şi la numărul de eritrocite/mm3. Colinesteraza globulară/mm3 sânge total / coliesteraza (în milioane). Determinarea cromului din sânge Generalităţi: cromul hexavalent are o toxicitate crescută comparativ cu cel trivalent, absorbindu-se uşor pe cale digestivă, respiratorie şi prin piele. Este responsabil de frecvenţa crescută a cancerului pulmonar. Principiul metodei: după mineralizarea sângelui cromul hexavalent formează cu difenilcarbazina un complex colorat în roz-violaceu a cărui intensitate este proporţională cu concentraţia cromului. Reactivi: -H2SO4 d = 1,84; -acid percloric 60%; -acid azotic d= 1,40 -NaOH 10 N; -permanganat de potasiu 0,1 N; -azidă de sodiu 5%; -fosfat monosodic (NaH2PO4 · 2H2O) 60%; -difenilcarbazină 0,1% în alcool etilic; -albastru de timol 0,4%; -bicromat de potasiu soluţie standard. Mod de lucru: 5 ml de sânge total se introduc într-un flacon Erlenmayer peste care se adaugă 1 ml acid sulfuric, 2 ml acid percloric, 1,5 ml acid azotic şi 2-3 perle de sticlă. Se acoperă cu o sticlă de ceas şi se încălzeşte pe baia de nisip până se obţine culoarea maronie. Se mai introduc câteva picături de acid azotic când are loc o reacţie energică. Se repetă adăugarea de acid azotic până când nu mai are loc reacţia. Se pune proba direct pe flacără pentru îndepartarea vaporilor albi de acid percloric. Se adaugă 10 ml apă bidistilată şi se continuă fierberea pe sită. Se răceşte şi apoi se adaugă o picătură de indicator albastru de timol şi hidroxid de sodiu până la culoarea roz. Se adaugă 0,5 ml permanganat de potasiu şi se introduce proba în baia de apă la 80˚C. Dacă culoarea roz a permanganatului a dispărut în 10’ se mai adaugă 0,3 ml permanganat şi se continuă fierberea 20’. Se scoate proba din baie şi se adaugă azidă de sodiu picătură cu picătură până la decolorarea completă. Se introduc 2 ml fosfat monosodic, pentru îndepărtarea interferenţei fierului şi 1 ml difenilcarbazină. După 5’ se citeşte extincţia la un spectrofometru la lungimea de undă de 540 nm în cuva de 1 cm. Calcul: µg Cr/100 ml sânge= C/V · 100. C= concentraţia în µg Cr din proba de sânge luată în lucru. V= cantitatea de sânge luată în lucru în ml. Observaţii: valoarea normală a cromului în sângele total este de 10 µg/100 ml sânge. Determinarea arsenului din păr Generalităţi: arsenul este un toxic cumulativ. O expunere a organismului la un mediu poluat cu arsen face să crească concentraţia acestui element atât în sânge cât şi în urină. Un test mai fidel al expunerii la arsen îl constituie determinarea lui în firele de păr. Principiul metodei: proba de păr se mineralizează şi arsenul se determină colorimetric cu dietildicarbamatul de argint. Reactivi: -alcool etilic; -eter etilic; -acid azotic d=1,40; -acid percloric 70%; -acid clorhidric 20%; Mod de lucru: aproximativ 3 g păr tăiat cât mai aproape de rădăcină se ţin 3-4 ore în eter etilic pentru degresare. Se filtrează şi se spală bine cu apă şi detergent, apoi se clăteşte cu apă bidistilată şi în final cu alcool etilic. Se usucă la temperatura camerei între două hârtii de filtru. După uscare se cântăresc exact 2 g păr, se introduc într-un flacon Erlenmayer, peste care se adaugă 10 ml acid azotic concentrat. Se acoperă vasul cu o sticlă de ceas, se încălzeşte pe baia de nisip până scade volumul la 2-3 ml. După răcire se introduc 5 ml apă bidistilată şi 10 ml acid azotic concentrat. Se continuă încălzirea pe baia de nisip până ce lichidul devine limpede, galben pai şi nu mai emite vapori bruni. Dacă nu s-a ajuns la acest stadiu se mai adaugă câţiva ml apă bidistilată şi 2-3 ml acid azotic şi se continuă fierberea cu grijă ca să nu se carbonateze. Se răceşte proba şi apoi se adaugă 1 ml acid percloric şi 2-3 ml apă bidistilată. Se continuă încălzirea vasului acoperit cu sticla de ceas până la decolorarea completă. Se ia sticla de ceas şi proba se încălzeşte până la evaporare la sec. Pentru îndepărtarea urmelor de acid percloric se reia reziduul de 2-3 ori cu câte 5 ml apă bidistilată şi se evaporă. Reziduul trebuie să fie cristalin şi perfect alb. Se trece reziduul, cantitativ, cu 10 ml acid clorhidric 20% în generatorul aparatului de determinat arsenul şi se continuă determinarea. Calcul: µg As/100 g păr = C/g · 100 C= concentraţia în µg As din proba de păr luată în lucru; G= cantitatea de păr luată în lucru, în g. Determinarea arsenului în sânge Principiul metodei: proba de păr se mineralizează şi arsenul se determină colorimetric cu dietildicarbamatul de argint. Reactivi: -alcool etilic; -eter etilic; -acid azotic d=1,40; -acid percloric 70%; -acid clorhidric 20%. Mod de lucru: se recoltează sângele venos pe fluorura de sodiu. Se măsoară exact 10 ml sânge şi se introduc într-un flacon Erlenmayer peste care se adaugă 10 ml acid azotic concentrat. Se fierbe pe baia de nisip şi se procedează în continuare ca la determinarea arsenului din păr. Calcul: µg As/100 ml păr = C/g · 100. C= concentraţia în µg As din proba de sânge; G= cantitatea de sânge luată în lucru, în ml. Obs.: cancentraţia normală a arsenului din sânge este de maximum 10 µg/100 ml. Determinarea arsenului în urină Principiul metodei: proba de păr se mineralizează şi arsenul se determină colorimetric cu dietildicarbamatul de argint. Reactivi: -alcool etilic; -eter etilic; -acid azotic d=1,40; -acid percloric 70%; -acid clorhidric 20%. Mod de lucru: se recoltează urina din 24 ore. Se iau 200 ml urină şi se introduc într-un flacon Erlenmayer peste care se adaugă 10 ml acid azotic concentrat. Se fierbe pe baia de nisip şi se procedează în continuare ca la determinarea arsenului în păr. Calcul: µg As/dm3 = C/V ·1000. C= concentraţia în µg As din proba de urină luată în lucru; V= cantitatea de urină luată în lucru, în ml. Obs.: concentraţia normală a arsenului în urină se considera a fi de 15-60 µg As/dm3 sau 100 µg As/urina din 24 ore. 쥁`