Referat Antibiotice

Mai jos puteti citi fragmente din Referat Antibiotice si de asemenea puteti face Download Referat Antibiotice

Citeste fragmente din Referat Antibiotice

Introducere Antibiotice şi antibactericide Termenul de “antibiotic” este folosit pentru o gamă largă de compuşi atât naturali cât şi semi-sintetici, care au efect antibacterian. Antibioticele se impart în cinci clase: peniciline, tetracicline, macrolide, aminoglicoze şi amfenicoli. Sulfoaminele, nitrofuranii si chinolonele nu sunt antibiotice în adevăratul sens al cuvântului pentru că sunt sintetice. Aceşti compuşi sunt utilizate de mulţi ani în tratementul bolilor animalelor producătoare de carne, lapte şi ouă. De asemenea au mai fost folosiţi şi pentru previnerea anumitor boli, dar şi pentru accelerarea creşterii. Legislaţia Uniunii Europene privind utilizarea antibioticelor Pentru protejarea sănătăţii consumatorilor Uniunea Europeană a stabilit limite maxime pentru rezidurile de produse medicamentoase în ţesuturile animaliere provenite. Aceste limite au se încadrează între factori de 10-100 pentru a asigura o hrană lipsită de reziduri nocive. Anumite antibiotice au fost interzise pentru animalele producătoare de carne, lapte şi ouă. Strategii analitice pentru determinarea rezidurilor de antibiotice La ora actuală există puţine metode capabile să măsoare concentraţiile de antibiotice la limitele impuse de UE pentru că unele antibiotice nu sunt solubile în solvenţi organici, ceea ce a îngreunat extragerea rezidurilor ţi stabilitrea concentaţiilor lor din ţesuturi. Alte antibiotice nu sunt suficient de volatile sau sunt prea instabile la temperaturi înalte pentru a permite analiza lor folosinr GC sau GC-MS. Astfel multe din metodele de măsurare a rezidurilor de antibiotice se bazează pe HPLC. Cu toate acestea HPLC nu este o metode suficient de specifică pentrua fi utilizată ca referinţă în UE. Peniciline Penicilinele (fig 10)-acidul 6-aminoampicilinic sunt administrat animalelor producătoare de carne, lapte şi ouă din motive terapeutice dar şi prolifice. Manipularea catenei laterale fost a modificat spectrul antibacterian al penicilinei pentru a include atât bacteriile gram-pozitive, cât şi cele gram-negative. O gamă largă de procedee LC-MS a fost aplicată pentru analiza penicilinei în ţesuturi, dar şi în lapte. S-au înregistrat metode care folosesc atât ioni pozitivi, cât şi ioni negativi. Comparaţia acestor metode în ceea ce priveşte sensibilitatea este dependentă de instrumentele folosite, dar şi de tehnicile de ionizare. Un număr mare de cercetători au folosit metoda cu ioni pozitivi. Mecanismul de fragmentare presupune deschiderea inelului β-lactam, urmată de hidratarea şi pierderea dioxidului de carbon. În 1989 Tyczkowska et al. a aplicat LC-MS la penicilina G în laptele de bovină. Laptele a fost diluat cu un volum echivalent de acetonitril-metanol-apă ( 40:20:20, v/v/v) pentru ca proteina să precipite. După aceea a fost centrifugat. Pentru măsurare s-a folosit un spectrometru de masă Finnigan Mat 4800. Sistemul LC consista dintr-un cartuş Brownlee Phenyl Spheri-5 cu fază mobilă de izopropanol 0.2M, acetat de amoniu şi acid acetic ( 12.5:85.5:2, v/v/v). LOD-ul a fost 100 μg/l bazat pe monitorarea ionului [M+H]+ la m/z 335 şi [M+H+H2O-CO2]+la m/z 309. demonstrat apropierea rezultatelor. LC-MS a fost folosită împreună cu detectarea UV de Boison et Al. pentru a confirma prezenţa penicilinei în lapte. După precipitarea proteinei probele au fost aplicate unui cartuş Bond Elut C18 SPE din care penicilinele au fost eluate cu aceto-nitril 0.0125 M şi acetat de amoniu (60:40, v/v). Separarea LC a fost obţinută folosind o coloană Nova-Pak C18 cu fază mobilă de acetonitril 0.15 M şi acetat de amoniu (10:90, v/v). s-a folosit un spectrometru de masă VG Trio II. Cercetătorii au declarat că răspunsul penicilinei G m/z 352 cu concentraţie de 5 μg/kg a fost slab. Voyksner şi Pack au studiat fragmentarea folosind tehnici electrospray şi ionspray cu Cid pentru a reproduce informaţia structurală a penicilinei G şi cloxacilinei. Fragmente din ionii de [M+H+H2O-CO2]+ nu au fost detectate la electrospray. Cum s-a crescut potenţialul, s-au format fragmente de ioni provenite de la inelul β-lactam. La diferemţe mai mari depotenţal s-au format ioni având valori de m/z sub 100. Studii echivalente asupra spectrului de ioni negativi folosind Analytica electrospray MS Model 100547-3 conectat la un spectometru de masă Hawlett –Packard 5989A. În general metoda cu ioni negativi a produs semnale cu intensităţi mai mici comparativ cu metoda ioni pozitivi. Fragmentarea rezultată din decarboilarea şi desfacerea inelului β-lactam, a format ioni [M-H-CO2]- β-lactam la m/z 289 şi [F-H-H2O]- la m/z 192 pentru penicilina G. În concluzie folosirea metodelor LC-MS pentru confirmarea penicilinelor pozitive la LC-UV nu a dat rezultatele corespunzătoare pentru că nu a întrunit standardele Lod-urilor. Tertacicline Tetraciclinele (fig 1), derivă din Streptomyces şi sunt active împotriva unei game largi de microorganisme gram-pozitive şi gram-negative. Acţionează prin inhibarea biosintezei proteice. Tetraciclinele nu au volatilitatea necesară pentru GC-MS. LC-MS a fost însă aplicată cu succes pentru analiza acestor compuşi. Kijak et al. a dezvoltat o metodă pentru determinarea tetraciclinei, oxitetraciclinei, clortetraciclinei în lapte folosind LC-MS. Un filtrat de lapte a fost pus într-un cartuş C18 SPE, care a fost spălat cu apă şi metanol. Rezidul de tetracilină a fost eluat în acid oxalic. Au fost folosite un Hawlett-Packard HP59980A şi un spectometru HP 5988A. Faza mobilă consista dintr acetonitril 0.05M, acid oxalic şi metanol. Metanul a fost folosit ca gaz reactiv. Datele au fost prezentate în concentra ţie normală 100μg/l. P Ì Î Ò ’ J L N ␃愁ĤᨀN P Ì Ð Ò 萑Ȝ葠ȜᨀS-a dovedit că adiţia de acid oxalic este necesară pentru a mări rezoluţia şi forma picurilor. Oka şi colaboratorii au folosit în 1994 FAB (Fast Atom Bombardment) LC-MS pentru analiza tetraciclinei, doxacilinei, oxitetraciclinei, clortetracicli-nei în miere şi a tetraciclinei, oxitetraciclinei, clortetraciclinei în ficat, rinichi şi muşchi de bovină folosind ionizaţia electrospray LC-MS-MS cu disociaţia cu coliziune indusă. Metoda lor presupunea amestecul probei cu soluţie tampon de EDTA-McIlvaine de pH 4.0. amestecul a fost centrifugat şi filtrat prin faza solidă folosind ubn cartuş Bond Elut C18 care a fost precondiţionat cu soluţie apoasă de EDTA. Rezidul de tetracilină a fost eluat folosind acetat de etil şi metanol. Apoi a fost uscat şdizolvat în apă. Separarea a fost făcută folosind o coloană TSK Super Octyl, fază mobilă fiind acetonitril 25% în soluţie apoasă 0.05% de acid triofloroacetic. Spectrometrul de masă folosit a fost Finnigan TSQ 7000. metoda a fost validată pentru cele patru tetraciline la o concentraţie de 100 μg/kg. În concluzie folosirea LC-MS în analiza rezidurilor de tetracicline a produ trei metode validate la concentraţii relevante. LC-MS pare să ofere şi o metodă de a măsura şi studia izomerii structurali ai clortetraciclinei care sunt imprtanţi în determinare conţinutului de reziduri în alimente. Macrolide Macrolidele sunt un grup de compuşi care conţin 12, 14, 16 inele macrociclice la care sunt ataşaţi amnioglucide sau glucide neutre. (fig 3). Un singur test LC-MS pentru determinarea rezidurilor a fost dezvoltat pentru fiecare membru din această grupă, cu excepţia jozamicinei; şi un test capabil să detecteze toaţi cei 5 compuşi. adiţionată pentru a facilita separarea stratelor apoase de cele organice. Diclormetanul a fost îndepărtat cu soluţie de clorură de sodiu, uscat şi rezidurile reconstituite în metanol. La HPLC s-a folosit o coloană de Zorbax Rx-C8, folosind ca eluant soluţie apoasă de acetonitril conţinând şi 0.2% acid formic. A fost solosit spectometrul de masă Sciex API III. Folosind LC-MS şi LC-MS-MS cu CID, eritromicina a putut fi detecdtată la 0.01 şi 0.05 μ/kg. De asemenea au putut fi detectate şi un mare număr de metabolite şi produşi de degradare. Cu toate acestea s-a cerut o metodă de curăţare pentru că analiza a doar câteva probe cerea înlocuirea coloanei. În 1994, Sanders şi Delepine, cel mai activ grup în analiza MS a macrolidelor, descriu o metodă LC-MS pentru analiza spiramicinei în muşchi de bovină. Spiramicina a fost extrasă din probe de muşchi în cloroform. Extactul a fost aplicat intr-un cartuş Bond Elut Diol care a fost mai întâi spălat cu cloroform. Rezidul de spiramicină a fost mai întâi eluat cu acid formic 2% în acetat de amoniu 0.05 M, metanol (35%) şi acetonitril (15%). Acest solvent fost în HPLC pentru separarea spiramicinei. El a fost trecut printr-o coloana LiChristophor RP18. a fost folosit un spectometrul de masă Hawlett-Packard 5989 A, folosind ca reactiv metan. Ionul molecular nu a fost prezent din cauza labilităţii spiromicinei, cea mai mare masă moleculară a fost cea a pierderii de apă [M+H-H2O]-. Folosind ionii la m/z 684, 683, 475, 330 şi 304 cercetătorii au putut să valideze concentratii de jumătate, aceleaşi şi dublu faţă de cele cerute de UE la 50 μ/kg de muşchi. În concluzie acest grup de compuşi este relativ bine acoperit, cu o metodă capabilă să determine reziduuri amestecate conţinând toţi membii acestui grup la concentraţii apropiate de cele stabilite de UE. Aminoglicozide Streptomices şi Micromonospora produc aminoglicozide. Ele sunt antibiotice cu spectru larg de activitate şi sunt formate dintr-un inel aminociclitol (2-deoxistrept amina în cele mai multe cazuri) legat de două sau mai multe amninoglucide în legătură glicozidică (fig 2). Analiza chimică a aminoglicozidelor a fost întotdeauna un punct slab al analiştilor. Aceşti comuşi prezintă toate proprietăţile fizicochimice care îngrunează metodele de confirmare. Fiind foarte hirdofilice extragerea lor este foarte dificilă. Se descompun la temperaturi mari facaând analiza GC sau GC-MS aproape imposibilă. Cu toate că LC-MS ar terbui sa fie o uneltă ideală în analiza acestor compuşi, până la data curentă s-au raportat doar două metode, amândouă folosind ionspray LC-MS. McLaughlin şi Henion au dezvoltat o metodă capabilă să detecteze spectiomicina, higromicina B, streptomicina ş dihidrostreptomicina în rinichi de bovină. Solubilitatea slabă a acestor compuşi ăn solvenţi organici a fost depăşită folosind dispersia fazei solide. Proba de rinichi a fost omogenizată cu cianopropil. După punerea într-un rezervor de extrcţie de 8ml, faza solidă a fost spălată cu hexan, acetat de etil şi metanol. Proba a fost eluată cu apă , apoi cu acid supfuric 0.05 M. S-a folosit o coloană Spherisorb ODS-2, cu o fază mobilă consistând din 8% acetonitril cu 10 sau 20 mM de acid pentafloropanic ca reactiv. Proba s-a introdus într-un aparat Sciex Taga 6000 E cu sursă APCI. Folosind SIM la m/z 351 pentru spectiomicină, m/z 265 pentru hirgomicina B, m/z 301 pentru streptomicină şi m/z 293 pentru dihidrostrrptomicină, aceste antibiotice au putut fi detectate în rinichi de bovină la concentraţia de 20 000 μ/kg. În concluzie, analiza rezidurilor de aminoglicozide folosind spectrometria de masă este imposibil de realizat într-un laborator obişnuit. Cu toate acestea, combinarea LC-MS-MS şi dispersiei fazei solide dă posibilitatea de confirmarea a tuturor acestor compuşi la standardele impuse de UE. Bibliografie W.M.A Niessen, A.B. Tinke, J. Cromatogr. A 703 (1995) P.J. Kijak, M.G. Leadbetter, M.H. THOMAS, e.a. Thompson, Biol. Mass Spect. 20 (1991) L.G. McLaughlin, J.D. Henion, J. Chromatorg 591 (1992) S. Pleasance, P. Blay, M.A. Quilliam, J. Cromatogr. 558 (1991) Cuprins TOC o "1-3" h z HYPERLINK l "_Toc73704368" Introducere PAGEREF _Toc73704368 h 2 HYPERLINK l "_Toc73704369" Peniciline PAGEREF _Toc73704369 h 3 HYPERLINK l "_Toc73704370" Tertacicline PAGEREF _Toc73704370 h 5 HYPERLINK l "_Toc73704371" Macrolide PAGEREF _Toc73704371 h 6 HYPERLINK l "_Toc73704372" Aminoglicozide PAGEREF _Toc73704372 h 8 HYPERLINK l "_Toc73704373" Bibliografie PAGEREF _Toc73704373 h 10 HYPERLINK l "_Toc73704374" Cuprins PAGEREF _Toc73704374 h 11 PAGE PAGE 2 쥁@